HIGH FIDELITY DNA POLYMERASEN
BESTELL-INFORMATION
PFU DNA POLYMERASE (2.5 U/µl)
|
Best.-Nr. |
Units |
10x pfu Reaktionspuffer |
5x Band Doctor |
Preis (EUR) |
| # PF 100 |
100 | 0.5 ml | 0.25 ml |
49,00 |
| # PF 500 |
|
2.4 ml |
1.2 ml |
200,00 |
LONG HIGH FIDELITY PCR ENZYM MIX (2.5 U/µl)
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Best.-Nr. |
Units |
10x HF Reaktionspuffer | 5x Band Doctor |
Preis (EUR) |
| # HF 100 |
100 | 0.5 ml | 0.25 ml |
49,00 |
| # HF 500 |
|
2.4 ml | 1.2 ml |
200,00 |
Unit
Definition
Lagerungspuffer pfu Polymerase
50 mM Tris/HCl (pH 8.0 bei 25°C), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 0.1% (v/v) Tween 20, 50% (v/v) Glycerol.
Lagerungspuffer HF Polymerase
10x
Reaktionspuffer
Keine Umwandlung von
kovalent geschlossener zirkulärer DNA in genickte DNA nachweisbar.
Exonuklease Assay
Kein Abbau (smearing) von
Fragmenten nachweisbar.
Ribonuklease
Assay
Funktioneller
Assay
Die pfu DNA Polymerase und die High Fidelity DNA Polymerase wurden mit der Amplifikation eines 20 kb Fragmentes humaner genomischer DNA getestet.
BASIS PROTOKOLL
|
Komponente |
Volumen
(in µL) |
|
10x pfu/HF Reaktionspuffer |
5 |
|
10 mM dNTP-Mastermix |
1 |
|
Vorwärts-Primer (10 pmol/µl) |
2 |
|
Rückwärts-Primer (10 pmol/µl) |
2 |
|
Template-DNA |
variabel |
|
5x Band Doctor |
0 – 20 |
|
pfu/HF Polymerase (2.5 U/µl) |
0.5 |
|
2x destilliertes, steriles
Wasser |
Zugabe auf Endvolumen von 50 |
|
Endvolumen |
50 |
CYCLING PROGRAMM
|
Schritt |
Temperatur
(in °C) |
Dauer |
Zyklen |
|
Enzym Aktivierung |
95 |
2 min |
1 |
|
Denaturierung |
95 |
20 sec |
10 – 40 |
|
Annealing |
AT * |
40 sec |
10 – 40 |
|
Extension |
72 |
Siehe Kapitel E (Anwendung) |
10 – 40 |
|
Finale Extension |
72 |
5 min |
1 |
AT* : Annealing Temperature; Wählen sie die niedrigere Tm der beiden Primer;
AT = Tm – 5°C ;
Tm = 2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)
ANWENDUNG
A. Template
|
Template DNA |
DNA
Menge |
Anzahl
der Zyklen |
|
Tierische genomische DNA |
50 – 200 ng |
25 – 35 |
|
10 – 50 ng |
30 – 40 |
|
|
Bakterielle genomische
DNA |
10 – 50 ng |
20 – 25 |
|
1 – 5 ng |
30 – 35 |
|
|
Plasmid und Lambda DNA |
1 – 5 ng |
20 – 30 |
B. DNA Polymerase
Für die Amplifikation langer Fragmente tierischer genomischer DNA sollte die Enzymmenge auf 2 oder 2.5 U erhöht werden.
C. 5x Band Doctor
Die Verwendung des Band Doctor ist optional. Bei der Amplifikation von DNA mit hohem GC-Anteil und komplexen Strukturen empfehlen wir eine finale Konzentration von 0.5x – 2x.
|
Komponente |
Volumen
(in µl) |
||||
|
Mix 1 |
Mix 2 |
Mix 3 |
Mix 4 |
Mix 5 |
|
|
10x pfu/HF Reaktionspuffer |
5 |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
10 mM dNTP-Mastermix |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
Vorwärts-Primer (10 pmol/µl) |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
Rüchwärts-Primer (10 pmol/µl) |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
Template-DNA |
x |
x |
x |
x |
x |
|
5x Band Doctor |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
|
pfu/HF Polymerase (2.5 U/µl) |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
|
2x destilliertes, steriles Wasser |
auf 50 |
auf 50 |
auf 50 |
auf 50 |
auf 50 |
D. 5x Primer Design
Die Primer können entweder manuell oder mit einer “Primer Design Software” hergestellt werden. Wir empfehlen einen Tm der hergestellten Primer von über 64°C und eine Annealing-Temperatur von über 58°C.
E. Extensionszeit
Die
Extensionszeit sollte bei dem pfu DNA Polymerase 2 min/kb dauern.
Bei der Amplifikation von Fragmenten mit mehr als 5 kb sollte eine Extensions-Temperatur von 68°C gewählt werden.
LAGERUNG
Lagerung beo -20°C für 24 Monate.
