TAQ DNA POLYMERASEN
BESTELL-INFORMATION
TAQ DNA POLYMERASE (5 U/µl)
|
Best.-Nr. |
Units |
10x Reaktionspuffer |
50 mM MgCl2 |
Preis (EUR) |
| # Taq 100 |
100 | 1 x 1.8 ml |
1.5 ml |
18,50 |
| # Taq 500 |
|
2 x 1.8 ml |
1.5 ml | 74,00 |
RED TAQ DNA POLYMERASE (1 U/µl)
|
Best.-Nr. |
Units |
10x Reaktionspuffer |
50 mM MgCl2 |
Preis (EUR) |
| # Red 100 |
100 | 1 x 1.8 ml |
1.5 ml |
21,00 |
| # Red 500 |
|
2 x 1.8 ml |
1.5 ml | 84,00 |
BESCHREIBUNG
Die Taq DNA Polymerase ist eine hoch gereinigte, rekombinante, thermostabile DNA
Polymerase. Sie wird aus E. coli
isoliert, das den Vektor für das DNA Polymerase Gen aus Thermus aquaticus trägt. Das Enzym erreicht seine höchste
Prozessivität bei 74°C und katalysiert die Polymerisierung von Nukleotiden der
DNA in der 5'→3'-Richtung in
Anwesenheit von Magnesiumionen. Sie besitzt eine hohe thermische Stabilität und
kann auch längeren Inkubationszeiten bei erhöhten Temperaturen (95°C)
standhalten.
Die Red Taq DNA Polymerase enthält einen
inerten roten Marker-Farbstoff, so dass eine Identifikation der Reaktionen, zu denen das Enzym zugegeben wurde,
möglich ist. Der
Farbstoff hat keine nachteiligen Auswirkungen auf die PCR.
Unit
Definition
Ein Unit ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um 10 nmol dNTP in 30 Minuten bei 74°C in eine säureunlösliche Form umzuwandeln.
Enzym-Lagerungspuffer
20 mM Tris/HCl (pH 8.0 bei 25°C), 30 mM KCl, 0.1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 50% (v/v) Glycerol.
10x
Reaktionspuffer
670 mM Tris/HCl (pH 8.8 bei 25°C), 166 mM (NH4)2SO4, 4.5% Triton®-X-100, 2 mg/ml Gelatine.
Mg2+-Lösung
50 mM MgCl2 (empfohlene finale Konzentration: 1 – 4 mM).
Keine Umwandlung von kovalent geschlossener zirkulärer DNA in genickte DNA nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 10 units Taq DNA Polymerase mit 1 µg verdauter DNA bzw. 1µl pBR322 DNA in 50 µl Taq Puffer mit KCL und 1.5 mM MgCl2 über 4 h bei 37°C bzw. 70°C).
Exodeoxyribonuklease Assay
Kein Abbau (smearing) von Lambda DNA/HindIII Fragmenten nachweisbar.(Reaktionsbedingungen: Inkubation von 10 units Taq DNA Polymerase mit 1 µg verdauter DNA bzw. 1µl verdauter DNA in 50 µl Taq Puffer mit KCL und 1.5 mM MgCl2 für 4 h bei 37°C bzw. 70°C).
Ribonuklease
Assay
Kein Abbau der 28S/18S Banden nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 10 units Taq DNA Polymerase mit 1 µg Gesamt-RNA in 50 µl Taq Puffer mit KCL und 1.5 mM MgCl2 für 4 h bei 37°C bzw. 70°C).
Funktioneller
Assay
BASIS PROTOKOLL
Mischen Sie
alle Komponenten vor der Verwendung vorsichtig, um Konzentrationsgradienten im Röhrchen zu
vermeiden und setzen Sie den Mix auf Eis in geeigneten PCR-Röhrchen an. Kein Vortexen oder Zentrifugieren.
|
Komponente |
Volumen
(in µL) |
Finale
Konzentration |
|
10x Reaktionspuffer |
5 |
1x |
|
50 mM MgCl2 Lösung |
1.5 |
1.5 mM |
|
12.5 mM dNTP-Mastermix |
1 |
250 µM |
|
Vorwärts-Primer |
variabel |
0.2 – 1 µM |
|
Rückwärts-Primer |
variabel |
0.2 – 1 µM |
|
Template DNA |
variabel |
< 1 µg |
|
Red Taq DNA Polymerase (1 U/µl) |
1.0 – 2.5 |
1 – 2.5 U |
|
Taq DNA Polymerase (5 U/µl) |
0.2 – 0.5 |
1 – 2.5 U |
|
2x destilliertes, steriles Wasser |
Zugabe auf Endvolumen von 50 |
|
|
Endvolumen |
50 |
|
CYCLING PROGRAMM
|
Schritt |
Temperatur
(in °C) |
Dauer |
Zyklen |
|
Enzym Aktivierung |
94 |
5 min |
1 |
|
Denaturierung |
94 |
30 sec |
23 – 35 |
|
Annealing |
53* |
45 sec |
23 – 35 |
|
Extension |
72 |
30 sec/kb |
23 – 35 |
|
Finale Extension |
72 |
30 sec/kb |
1 |
*: Wählen Sie die Temperätur ungefähr 5°C unter der Tm der Primer.
TIPPS UND HINWEISE
- Vortexen Sie die MgCl2-Lösung vor der Verwendung gründlich.
- Mischen Sie alle Komponenten vorsichtig vor der Verwendung.
- Mixen Sie die Komponenten nach dem Pipettieren durch vorsichtiges Schwenken.
- Halten Sie die Ansätze so lange wie möglich auf Eis.
Die Reaktionsbedingungen (Inkubationstemperatur und –dauer, Konzentrationen der Template-DNA, der Primer, der Magnesium-Ionen und des Enzyms) sind abhängig von dem verwendeten Template und der Primer. Die optimale Mg2+-Konzentration liegt bei 1 – 4 mM und muss empirisch ermittelt werden. Für die meisten Anwendungen ist eine Konzentration von 1.5 mM Mg2+ ideal. Für anspruchsvollere Amplifikationen genomischer DNA, bei denen höhere Mg2+-Konzentrationen (2 – 3 mM) vorliegen müssen, ist dem Set eine separate 50 mM MgCl2-Lösung beigefügt.
OPTIMIERUNG DER MgCl2 KONZENTRATION IM REAKTIONSANSATZ
|
Finale Konzentration an MgCl2 in 50 µl Reaktionsvolumen |
Zugabe 50 mM MgCl2 Lösung |
|
1.5 mM |
1.5 µl |
|
1.75 mM |
1.75 µl |
|
2.0 mM |
2.0 µl |
|
2.5 mM |
2.5 µl |
|
3.0 mM |
3.0 µl |
|
4.0 mM |
4.0 µl |
Lagerung bei -20°C für 24 Monate.
WARNUNG
