PFU MASTER MIX / LONG RANGE PCR MASTER MIX
BESTELL-INFORMATION
HIGH FIDELITY PCR, 2x PFU MASTER MIX (pfu DNA Polymerase, 2.5 U/µl)
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Best.-Nr. |
Anzahl der 50 µl Reaktionen |
Volumen |
5x Band Doctor |
Preis (EUR) |
| # R 550 | 100 | 2 x 1.25 ml | 0.25 ml |
89,50 |
| # R 551 |
|
10 x 1.25 ml |
1.2 ml |
375,00 |
2x LONG RANGE PCR MASTER MIX (High Fidelity PCR Enzyme Mix, 2.5 U/µl)
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Best.-Nr. |
Anzahl der 50 µl Reaktionen |
Volumen |
5x Band Doctor |
Preis (EUR) |
| # R 560 | 100 | 2 x 1.25 ml | 0.25 ml |
89,50 |
| # R 561 |
|
10 x 1.25 ml |
1.2 ml |
375,00 |
BESCHREIBUNG
Der
2x PCR Master Mix beinhaltet alle benötigten Reagenzien für eine Real Time PCR,
so dass die PCR leicht und einfach durchzuführen ist.
QUALITÄTSKONTROLLE
|
FUNKTIONELLE TESTS |
SPEZIFIKATION |
|
4 kb (High Fidelity PCR) |
Amplifikation erfolgreich |
|
30 kb (Long and Accurate PCR) |
Amplifikation erfolgreich |
|
PHYSIKALISCHE TESTS |
SPEZIFIKATION |
|
Endonuklease Assay |
Keine Aktivität nachweisbar |
|
DNase Assay |
Keine Aktivität nachweisbar |
|
RNase Assay |
Keine Aktivität nachweisbar |
BASIS PROTOKOLL
Pipettieren Sie die folgenden Komponenten auf Eis in ein PCR-Reaktionsgefäß und geben Sie die entsprechende Menge Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 50 µl zu erreichen:
|
Komponente |
Volumen
(in µl) |
||||
|
Mix 1 |
Mix 2 |
Mix 3 |
Mix 4 |
Mix 5 |
|
|
2x PCR Master Mix |
25 |
25 |
25 |
25 |
25 |
|
Template DNA |
x |
x |
x |
x |
x |
|
Primer (10 µM, jeweils) |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
|
5x Band Doctor |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
|
2x dest., steriles Wasser |
auf 50 |
auf 50 |
auf 50 |
auf 50 |
auf 50 |
Mischen Sie alle Komponenten vor der Verwendung vorsichtig, um Konzentrationsgradienten im Röhrchen zu vermeiden. Kein Vortexen oder Zentrifugieren. Die optimalen Konzentrationen der Primer, der Templates sowie das Temperaturprofil im Cycler müssen für jede Reaktion individuell angepasst werden.
CYCLING PROGRAMM FÜR 4 kb PCR ASSAY
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Schritt |
Temperatur (in °C) |
Dauer |
Zyklen |
|
Enzym Aktivierung |
95 |
2 min |
1 |
|
Denaturierung |
95 |
20 sec |
10 – 40 |
|
Annealing |
AT* |
40 sec |
10 – 40 |
|
Extension |
72 |
2 min/kb |
10 – 40 |
|
Finale Extension |
72 |
5 min |
1 |
CYCLING PROGRAMM FÜR 30 kb PCR ASSAY
|
Schritt |
Temperatur
(in °C) |
Dauer |
Zyklen |
|
Enzym Aktivierung |
95 |
2 min |
1 |
|
Denaturierung |
95 |
20 sec |
10 – 40 |
|
Annealing |
AT* |
40 sec |
10 – 40 |
|
Extension |
72 |
30 sec/kb |
10 – 40 |
|
Finale Extension |
72 |
5 min |
1 |
AT* : Annealing Temperature; Wählen sie die niedrigere Tm der beiden Primer;
AT = Tm – 5°C ; Tm = 2°C x (A+T) + 4°C x (G+C)
ANWENDUNG
A. Template
|
Template DNA |
DNA
Menge |
Anzahl
der Zyklen |
|
Tierische genomische DNA |
50 – 200 ng |
25 – 35 |
|
10 – 50 ng |
30 – 40 |
|
|
Bakterielle genomische
DNA |
10 – 50 ng |
20 – 25 |
|
1 – 5 ng |
30 – 35 |
|
|
Plasmid und Lambda DNA |
1 – 5 ng |
20 – 30 |
B. 5x Band Doctor
Die Verwendung des Band Doctor ist optional. Bei der Amplifikation von DNA mit hohem GC-Anteil und komplexen Strukturen empfehlen wir eine finale Konzentration von 0.5x – 2x.
C. 5x Primer Design
Die Primer können entweder manuell oder mit einer “Primer Design Software” hergestellt werden. Wir empfehlen einen Tm der hergestellten Primer von über 64°C und eine Annealing-Temperatur von über 58°C.
D. Extensionszeit
Die
Extensionszeit sollte bei dem pfu Master Mix 2 min/kb dauern.
LAGERUNG
Lagerung bei -20°C für 12 Monate.
