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Produkte

DNA Polymerasen

Hot Start DNA Polymerasen

HOT START DNA POLYMERASEN

BESTELL-INORMATION

HOT START DNA POLYMERASE (5 U/µl)

Best.-Nr.	Units	10x Reaktionspuffer	50 mM MgCl₂	5x Lösung R (optional)	Preis (EUR)
# HS 100	100	1 x 1.8 ml	1.5 ml	1 x 1.8 ml	31,50
# HS 500	500	2 x 1.8 ml	1.5 ml	2 x 1.8 ml	126,00

RED HOT START POLYMERASE (5 U/µl)

Best.-Nr.	Units	10x Reaktionspuffer	50 mM MgCl₂	5x Lösung R (optional)	Preis (EUR)
# Red-HS 100	100	1 x 1.8 ml	1.5 ml	1 x 1.8 ml	38,50
# Red-HS 500	500	2 x 1.8 ml	1.5 ml	2 x 1.8 ml	150,00

BESCHREIBUNG

Die Verwendung der Hot Start DNA Polymerase empfiehlt sich für hochspezifische PCR Reaktionen. Durch die thermische Aktivierung wird die unspezifische Bindung von Primern und die Bildung von Primer-Dimeren bei niedrigen Temperaturen im PCR Setup verhindert.

Die Hot Start DNA Polymerase ist eine hoch gereinigte, rekombinante, thermostabile DNA Polymerase. Sie wird aus E. coli isoliert, das den Vektor für das DNA Polymerase Gen aus Thermus aquaticus trägt. Das Enzym erreicht seine höchste Prozessivität bei 74°C und katalysiert die Polymerisierung von Nukleotiden der DNA in der 5'→3'-Richtung in Anwesenheit von Magnesiumionen. Sie besitzt eine hohe thermische Stabilität und kann auch längeren Inkubationszeiten bei erhöhten Temperaturen (95°C) standhalten.

Hot Start DNA Polymerase zeigt keine 3'→5' Exonukleaseaktivität.

Die Red Hot Start DNA Polymerase enthält einen inerten roten Marker-Farbstoff, so dass eine Identifikation der Reaktionen, zu denen das Enzym zugegeben wurde, möglich ist. Der Farbstoff hat keine nachteiligen Auswirkungen auf die PCR.

Aktivierungsschritt

Hot Start Polymerase benötigt keinen verlängerten Erwärmungs- oder Denaturierungsschritt. Die Antikörper am aktiven Zentrum der Polymerase werden durch die steigende Temperatur während Aktivierungsphase inaktiviert.

Unit Definition

Ein Unit ist die Enzymmenge, die benötigt wird, um 10 nmol dNTP in 30 Minuten bei 74°C in eine säureunlösliche Form umzuwandeln.

10x Reaktionspuffer

670 mM Tris/HCl (pH 8.8 bei 25°C), 166 mM (NH₄)₂SO₄, 4.5% Triton^®-X-100, 2 mg/ml Gelatine.

Mg²⁺-Lösung

50 mM MgCl₂ (empfohlene finale Konzentration: 1 – 4 mM).

Endodeoxyribonuklease Assay

Keine Umwandlung von kovalent geschlossener zirkulärer DNA in genickte DNA nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 10 units Hot Start Taq DNA Polymerase mit 1 µg verdauter DNA bzw. 1µl pBR322 DNA in 50 µl Hot Start Taq Puffer mit KCL und 1.5 mM MgCl₂ über 4 h bei 37°C bzw. 70°C).

Exodeoxyribonuklease Assay

Kein Abbau (smearing) von Lambda DNA/HindIII Fragmenten nachweisbar.(Reaktionsbedingungen: Inkubation von 10 units Hot Start Taq DNA Polymerase mit 1 µg verdauter DNA bzw. 1µl verdauter DNA in 50 µl Hot Start Taq Puffer mit KCL und 1.5 mM MgCl₂ für 4 h bei 37°C bzw. 70°C).

Ribonuklease Assay

Kein Abbau der 28S/18S Banden nachweisbar. (Reaktionsbedingungen: Inkubation von 10 units Hot Start Taq DNA Polymerase mit 1 µg Gesamt-RNA in 50 µl Hot Start Taq Puffer mit KCL und 1.5 mM MgCl₂ für 4 h bei 37°C bzw. 70°C).

Funktioneller Assay

0.1 ng Lambda DNA wurde mit spezifischen Primern amplifiziert, so dass eine deutliche 500 bp Bande nachweisbar ist.

BASIS PROTOKOLL

Mischen Sie alle Komponenten vorsichtig vor der Verwendung um Konzentrationsgradienten im Röhrchen zu vermeiden und setzen Sie den Mix auf Eis in geeigneten PCR-Röhrchen an. Kein Vortexen, kein Zentrifugieren. Pipettieren Sie die folgenden Komponenten in ein PCR-Reaktionsgefäß und geben Sie die entsprechende Menge Wasser hinzu um ein Endvolumen von 50 µl zu erreichen:

Komponente	Volumen (in µL)	Finale Konzentration
10x Reaktionspuffer	5	1x
50 mM MgCl₂ Lösung	1.5	1.5 mM
5 mM dNTP-Mastermix	2	200 µM
Vorwärts-Primer	variabel	0.2 – 1 µM
Rückwärts-Primer	variabel	0.2 – 1 µM
Template-DNA	variabel	< 1 µg
Hot Start DNA Polymerase (5 U/µl)	0.2 – 0.5	1 – 2.5 U
2x destilliertes, steriles Wasser	Zugabe auf Endvolumen von 50
Endvolumen	50

Um den Background zu verringern kann optional “Lösung R” (10 µl der 5x Lösung R, Endkonzentration 1x) hinzugefügt werden.

CYCLING PROGRAMM

Schritt	Temperatur (in °C)	Dauer	Zyklen
Enzym Aktivierung	94	5 min	1
Denaturierung	94	30 sec	23 – 35
Annealing	53*	45 sec	23 – 35
Extension	72	30 sec/kb	23 – 35
Finale Extension	72	30 sec/kb	1

*: Wählen Sie die Temperätur ungefähr 5°C unter der T_m der Primer.

TIPPS UND HINWEISE

Vortexen Sie die MgCl₂-Lösung vor der Verwendung gründlich.
Mischen Sie alle Komponenten vorsichtig vor der Verwendung.
Mixen Sie die Komponenten nach dem Pipettieren durch vorsichtiges Schwenken.
Halten Sie die Ansätze so lange wie möglich auf Eis.

Die Reaktionsbedingungen (Inkubationstemperatur und –dauer, Konzentrationen der Template-DNA, der Primer, der Magnesium-Ionen und des Enzyms) sind abhängig von dem verwendeten Template und der Primer. Die optimale Mg²⁺-Konzentration liegt bei 1 – 4 mM und muss empirisch ermittelt werden. Für die meisten Anwendungen ist eine Konzentration von 1.5 mM Mg²⁺ ideal. Für anspruchsvollere Amplifikationen genomischer DNA, bei denen höhere Mg²⁺-Konzentrationen (2 – 3 mM) vorliegen müssen, ist dem Set eine separate 50 mM MgCl₂-Lösung beigefügt.

OPTIMIERUNG DER MgCl₂ KONZENTRATION IM REAKTIONSANSATZ

Finale Konzentration an MgCl₂ in 50 µl Reaktionsvolumen	Zugabe 50 mM MgCl₂Lösung
1.5 mM	1.5 µl
1.75 mM	1.75 µl
2.0 mM	2.0 µl
2.5 mM	2.5 µl
3.0 mM	3.0 µl
4.0 mM	4.0 µl

LAGERUNG

Lagerung bei -20°C für 24 Monate.

WARNUNG

Nur für Forschungszwecke. Nicht geeignet für die Diagnose von Krankheiten bei Mensch und Tier. Keine interne oder externe Anwendung am Menschen oder Tier.

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